X
تبلیغات
نماشا
رایتل

اصول باروری 

انجماد اسپرم 

انجماد جنین 

انجماد تخمک 

پیوند تخمدان

مبحث طب تولید مثل به سرعت در حال پیشرفت می باشد . ما الان در دورانی زندگی می کنیم که کارهایی که یک دهه قبل غیر ممکن بود الآن ممکن شده است و تعصباتی که در طول قرنها وجود داشته اند مورد بحث قرار می گیرند.

با تشکر ازبوجود اورندگان روشهای جدید حفاظت بافتی به طریق انجماد .

.ناباروری و نارسایی زودرس تخمدان بخصوص زمانی که در اثر درمانهای دارویی ایجاد می شود دیگر شرایط غیر قابل اجتنابی نمی باشد . در حالیکه موفقیت انجماد تخمک کم کم به حد قابل قبولی برای استفاده در بیمارانی که با ریسک نارسایی زودرس تخمدان در اثر درمانهای دارویی مواجه هستند و یا برای ایجاد بانکهای تخمک برای اهدای تخمک می رسد انجماد و پیوند تخمدان نیز بعنوان روشی برای بازگرداندن حالت یائسگی و ایجاد قدرت باروری بعنوان یک راه حل مطرح می گردد. در حال حاضر بیان وجود سلولهای جرم سل اولیه در بافت مغز استخوان انسان بسیار (intriguing) است.

در حالیکه پیوند مغز استخوان و سلولهای خون محیطی در جوندگانی که تخمدان آنها تحت شیمی درمانی قرار گرفته است موجب ایجاد فولیکولهای پریموردیال شده است.مارکرهای Germ  stem cell از قبل در مغز استخوان و خون محیطی انسان یافته شده است (1)

بر طبق این تئوری تخمدانها سیگنالهایی را برای سلولهای پایه جرم سل موجود در مغز استخوان ایجاد می کنند که موجب آزاد شدن شدن فولیکولهای جدید به جریان خون در هنگام نیاز  می شود.  این نظریه نسبت به نظریه قبلی که متعصبانه بیان می کرد که رزرو تخمدان  قبل از تولد از پیش تعیین می شود همه را دچار شوک و تضاد نموده است.

البته این هیپوتز شواهد اثبات کننده ای در انسان و پریماتهای غیر انسان دارد . آنچنان که در مطالعه زیر بیان می شود.

یک مورد پیوند تخمدان در اثبات هیپوتز ((Stem Germ cell

  در یک بیمار 29 ساله با بیماری هوجکین عود کننده یک تخمدان قبل از شیمی درمانی اولیه جهت پیوند سلولهای هماتوپویتیک اتولوگ از بدن خارج و فریز شد.

شیمی درمانی حاوی دوز بالای مواد الکیله کننده بود که بلافاصله حالت یائسگی را در بیمار ایجاد نمود و بیمار به مدت 5/2 سال در حالت منوپوز باقی ماند تا وقتی که بافت تخمدان وی به صورتی که در زیر توضیح داده خواهد شد بصورت نوارهایی در زیر جلد قسمت قدامی شکم بیمار پیوند شد. دو ماه بعد از پیوند بیمار رشد فولیکولها را در زیر پوست خود احساس کردو خود به خود حامله شد سه هفته بعد از ختم این حاملگی غیر عادی بیمار در بافت پیوندی خود رشد فولیکولها را حس نموده و یک هفته بعد قاعدگی طبیعی اتفاق افتاد در سیکل بعدی تخمک گذاری با تعیین بالا رفتن ناگهانی LH و همراه با رشد فولیکولها در گرافت اثبات شد . در همین زمان بیمار مقاربت داشت و بالافاصله حامله شد و یک نوزاد دختر سالم و ترم بدنیا آورد.

هر چند از نظر تئوری امکان دارد که این حاملگی ها به دنبال پیوند تخمدان . در اثر یک اتفاق نادر و  بهبود وضعیت تخمدان بعد از کموتراپی ایجاد شده باشد ولی اتفاق افتادن 2 بار حاملگی در عرض 3 ماه بعد از پیوند تخمدان  بسیار سوال برانگیز است.

مخصوصاً با توجه به این حقیقت که این بیمار در طول 5/2 سال قبلی که در حالت منوپوز بود به هیچوجه حامله نشده بود.

- آیا امکان دارد که شیمی درمانی به جای اینکه فقط توده فولیکولهای پریموردیال اولیه را از بین برده باشد قدرت تخمدان در تحریک ایجاد Germ  stem cell در مغز استخوان را از بین برده باشد؟

آیا بازگشت فعالیت تخمدان بعد از انجام شیمی درمانی عقیم کننده در نتیجه برقراری ساخت فولیکولهای پریموردیال بصورت denovo صورت گرفته است ؟

آیا تخمدان پیوند شده توانسته است سیگنالهایی را به جای تخمدان عقیم شده ایجاد کند تا ساخت فولیکولهای پریموردیال آغاز گردد؟   یا مغز استخوان را تحت تأثیر قرار دهد تا ساخت Germ  stem cell را برای تخمدان عقیم شروع نماید.

هرچند  فقط مطالعات آزمایشگاهی آینده نشان خواهد داد که آیا انجام این کارها در انسان امکان پذیر بوده و عامل ایجاد حاملگی در موارد پیوند تخمدان می باشد. یا خیر البته شواهد دال بر نوسازی شدن سلولهای Germ  stem cell  در مطالعات روی انسان و پریماتهای غیر انسان حدود 50 سال قبل منتشر شده بود. بر اساس دلایل بافت شناسی Schwarz et al (21) حتی در سال 1949 عنوان نمود که اووژنزدر تخمدان های بالغ ادامه دارد.

یک مطالعه توسط(3) Vermande – Van –Eck  بحث محکمتری را در اثبات  تولید فولیکولهای پریموردیال در تخمدانهای پریماتهای غیر انسان پیش رو گذاشت. در این مطالعه بر اساس میزان اترزی و زمانی که برای پاکسازی سلولهای اترتیک از تخمدان مورد نیاز است.تخمین زده شد که 90 درصد از رزرو تخمدان در 2 سال اول زندگی کاهش می یابد با توجه به اینکه میمونهای مورد استفاده در این مطالعه حتی تا 4 سالگی بلوغ را تجربه نکردند و تا 20 سال بارور باقی ماندند . اووژنز جدید و ایجاد فولیکولهای پریموردیال جدید در تخمدانهای بعد از تولد یک احتمال واقعی باقی ماند .رشته پزشکی تولید مثل یک آینده مهیج را پیش رو دارد وبنظر مولف(K.O) تنها با داشتن یک ذهن باز به روشهای التروناتیو و جایگزین  اصول قبلی که با تعصب پذیرفته شده اند ما می توانیم پیشرفت نمائیم . یک مثال بارز برای این تحول پیشرفت روشهای لاپاروسکوپیک توسط کسانی مثل دکتر نزهت است که در دهه قبل مارا به شوک وا می داشت ولی الآن جزء روشهای استاندارد مراقبت پزشکی است . مطالبی که در ادامه می آید نگاه گذرایی است به آنچه که آینده رشته ما را در اختیار دارد.

انجماد اووسیت:

انجماد اووسیت پتانسیل حفظ باروری را در خانمهایی که در معرض از دست دادن عملکرد تخمدان به علت درمان طبی یا جراحی و یا کسانی که در معرض خطر نارسایی زودرس تخمدان می باشند امکانپذیر می سازد . این تکنیک همچنین ممکنست موجب از بین رفتن محدودیت های اخلاقی موجود در مورد انجماد جنین نیز بشود و ایجاد یک بانک اووسیت را برای عملی کردن اهداء اووسیت مقدور می سازد. ایجاد بانک اووسیت همچنین می توان استراتژی باشد که بر کاهش مرتبط با سن تعداد وکیفیت اووسیت فائق آید . انجماد اووسیت همنین در سیکلهایی از TESE یا IVF که اسپرم به دست نمی آید میتواند مورد استفاده قرار گیرد. جدول (1-1-7)

 مشکلات موجود بر سر راه انجماد تخمک، سفت شدن زونا پلوسیدا در مراحل فریز آب شدن و صدمات سیتواسکلتون تغییرات گرانولهای کورتیکال آسیب مخروط میوز و افزایش ریسک پلی پلوئیدی و آنوپلوئیدی و فعال شدن پارتنوژنیک اووسیت می باشد.

متغییرهایی که انجماد موفقیت آمیز تخمک را تحت تأثیر قرار می دهند عبارتند از کیفیت اووسیت سن- مرحله بلوغ  اووسیت- وجود توده کومولوس- نوع کرایوپروتکتنت و پروتکل انجماد تخمک است .

) (slow freeze –rapid thaw vitrifical)   6-4 ) میزان باروری غیر طبیعی بعد از انجماد تک تخمک بین 15-5 درصد متفاوت است . در انتها PGD یا حداقل مشخص نمودن کاریوتایپ پره ناتال  تا زمانی که اطلاعات در مورد ایمن بودن این روش بدست آید فعلاً توصیه می شود.

تاریخچه :

کشفی که درسال 1948 توسط Polge- Smith –Parks بعمل آمد و نشان داد که اسپرم fowl می تواند در دمای 70 درجه سانتیگراد در حضور گلیسرول زنده بماند شروع تئوری انجماد سلولهای جنینی و بافتها بود . اولین موفقیت در مورد انجماد تخمک در سال 1977 در تخمک موش صورت گرفت که در سایر حیوانات نیز تکرار شد. در سال 1983   Trounson , Mohr/ (8)  نشان دادند که جنین انسان بعد از  انجماد می تواند از حالت انجماد خارج شده و به رشد خود ادامه دهد و منجر به حاملگی شود.

دو نوع روش انجماد تخمک وجود دارد : روش انجماد آهسته و ویتریفیکلاسیون که اولین حاملگی انسان با استفاده از این روش در سال 1986 توسط  Chen  (9) گزارش شد.

در سال 1997 ، (10) Porcu et al اولین تولد زنده انسان را به دنبال انجماد تخمک بالغ انسان و سپس میکرو اینکشن (ICSI) گزارش کردند.

Cha et al (11) در سال 1999 یک مورد حاملگی از تخمک نابالغ منجمد وIVF با استفاده از محلول 5/5 مول در لیتر اتیلن گلیکول بعنوان cryoprotectant گزارش   کردند .

انجماد آهسته اووسیت بالغ انسان:

 اووسیت باید در مدت کمی بعد از بلوغ در عرض 38 تا 40 ساعت بعد از تزریقHCG منجمد شود. بیشتر پروتکل ها روش انجماد آهسته و آب شدن سریع با استفاده از 1و2 پروپاندیول(PROH)  و ساکاروز را بعنوان Cryoprotectant بهره می گیرند مدیاهای با میزان سدیم  کم نیز اخیراً معرفی شده اند.

اختلافات قابل ملاحظه ای در مقالات در میزان زنده ماندن تخمک بعد از آب شدن - میزان باروری کلیواژ و حاملگی بعد از انجماد تخمک بالغ وجود دارد. لذا انجماد تخمک هنوز به اندازه انجماد جنین کارایی ندارد میزان تولد زنده نسبت به اووسیت در روش انجماد تخمک متوسط 2- 7/1% است در حالیکه این نسبت در تخمک تازه به 7% می رسد این مقادیر در مورد جنین به 20% در مقابل 60% می رسد (12). برخی از گزارشات اصلی درمورد انجماد جنین در جدول( 1-1-7  )آورده شده است.

ویتریفیکاسیون تخمک بالغ انسان:

ویتریفیکلاسیون عبارتست از انجماد یک محلول به حالت شیشه ای بدون ایجاد کریستالهای یخ می باشد . برای این کار استفاده از غلظت بالای مواد جلوگیری کننده از یخ زدگی (cryoprotectant) و سرد شدن با سرعت زیاد انجام می گیرد. ماده ای که بیشتر از همه بعنوان کرایوپروتکتانت استفاده می شود اتیلن گلیکول می باشد  زیرا توکسیسیته آن نسبتاً پائین بوده و قدرت عبور آن از زونا و دیواره سلول بالاست .(جدول2-1-7)

بعضی از مؤلفین اظهار می دارند که ویتربفیکلاسیون برای انجماد تخمک بسیار مناسب تر از روش انجماد آهسته است. زیرا کنترل روی نسبت دهیدراسیون/ غلظت محلول وجود داشته و مدت کمی بیرون انکوباتور می ماند و شوک حرارتی نیز کم است و زوناپلوسیدا حفظ می شود. نتایج ویتربفیکلاسیون اوسیت انسان در جدول 2-1-7 آورده شده است. تغییراتی که میتواند نتایج ویتربفیکلاسیون را تغییر دهدعبارتست  از افزودن ماکرو مولکول های سنتتیک میکرواینجکشن  قندها - استفاده از ظروف انجماد مختلف(...) و پایدار کننده های سیتواسکلتون مانند (Taxanes) می باشد .اخیراً   Liebermann  (27) به 80% سوروایوال در ویتریفیکلاسیون 1120 اوسیت بالغ انسان با استفاده از مخلوظ اتیلن گلیکول ودی متیل سولفوکسید(DMSO)

-           پلی مرماکرومولکول- سوکروز و جانشین سنتتیک سرم دست یافت. هرچند از این روش فقط 10 مورد زایمان حاصل شد و پتانسیل واقعی این روش باید مورد بررسی قرار گیرد. از آنجائیکه اووسیت ها در یک سیستم باز ویتریفیه می شوند انتقال ویروسی در نیتروژن مایع نیز محتمل می باشد.

انجماد اوسیت نابالغ:

اووسیت نابالغ نیز می تواند در روند انجماد زنده بماند و سپس بلوغ تا

مرحله متافازدو بعداً صورت بگیرد (33) کروموزمها در اووسیت مرحله پروفاز در دوک تقسیم درگیر نشده اند و از نظر تئوری احتمال آسیب دوک در مرحله فریز و آب شدن کمتر است . اووسیت های نابالغ را می توان در یک سیکل تحریک نشده معمولی مثلاً در جریان یک عمل ژنیکولوژیک بدست آورد .(جدول 3- 1- 7) بیماران دارای تخمدان پلی سیستیک چون تعداد زیادی تخمک نابالغ تولید می کنند ممکنست از این روش سود ببرند . بعلاوه اووسیت های نابالغ منجمد شده موجب از بین رفتن احتمال خطر تحریک بیش از حد تخمدان (سندرم OHSS) و اجتناب از افزایش استروژن در مواردی که مضر تلقی می شود( بیماران با کانسر پستان یا بیماران در معرض خطر ترومبوامبولی) می شود، این روش همچنین می تواند به بیماران مبتلا به کانسر که وقت کافی برای تحریک تخمدان قبل از شروع شیمی درمانی ندارند کمک نماید.از آنجائیکه تعداد بسیار معدودی از موارد تولد زنده به دنبال انجماد اووسیت نابالغ گزارش شده است. کاربرد این روش هنوز باید مورد بررسی قرار گیرد.

بالغ سازی تخمک در خارج از بدن : (IVM)

گرفتن تخمک نابالغ و بالغ سازی آن در خارج از بدن موجب عدم نیاز به سیکلهای طولانی و گران قیمت تحریک تخمدان و همچنین جلوگیری از سندرم تحریک بیش از حدتخمدان و جلوگیری از قرار گیری در معرض مقادیر بالای استروژن بخصوص در بیماران پر خطر می باشد.

تاریخچه:

Gregory  Pincus   (41) در سال 1935 و Roger Edwards در سال 1965 (42) نشان دادند که تخمک وقتی از فولیکول آنترال گرفته می شوند گاهی بطور خود به خود می تواند شروع به تقسیم میوز نماید. تحقیقات  دهه 1970 و 1980 نشان دادند که مراحل بسیاری در روند بلوغ تخمک ضروری هستند از جمله نیاز به سلولهای کومولوس اهمیت اندازه فولیکول و اندازه اووسیت. مکانیسم های مولکولی در برقرار شدن روند میوز و شرایط کشت سنتز پروتئین و بروز ژن در روند بالغ سازی اووسیت و اثر هورمون محرک فولیکولی hCG روی آن.

هر چند حاملگی بدنبال استفاده از روش IVM که از تخمکهای بدست آمده در طی عمل IVF استفاده شده بود در سال 1983 گزارش شده بود ولی اولین حاملگی انسان بدنبال استفاده از اووسیت نابالغ بدست آمده در یک سیکل تحریک نشده تخمدان توسط Cha et al در سال 1991 گزارش شد (43)

Trounson و همکاران (44) اولین حاملگی به روش IVM را در یک بیمار مبتلا به PCO گزارش کردند.

بالغ سازی اووسیت بدست آمده از یک فولیکول آنترال:

اوسیت برای انجام IVM را می توان در جریان یک سزارین نیز از تخمدان گرفت (45 و 43) و در جریان فازهای مختلف سیکل تخمدان و 94 از بیماران مبتلا به pco و بعد از تحریک تخمدان نیز می توان تخمک نابالغ بدست آورد (47- 46- 44) اووسیت های نابالغ که در مرحله لوتئال بدست می آید حتی ممکن نسیت به آنهایی که در مرحله فولیکولار بدست می آید میزان بلوغ بیشتری از خود نشان بدهند. هرچند این یافته در همه مطالعات تأیید نشده است (48) بوجود آمدن فولیکول غالب روند تکامل سایر فولیکولهای نابالغ بدست آمده از فولیکول های انترال را که دچار اترزی نشده اند تحت تأثیر قرار نمی دهد(49)

البته افزایش سن و میزان بالای FSH روز سوم استروژن بالای 200 pmol/lit و اینهیبین pg/ml  10<A  با میزان پائین بلوغ اووسیت و میزان پایین حاملگی همراه بودند (50)  قدرت اووسیت نابالغ برای ادامه به روند میوز بیشتر به اندازه فولیکول بدست آمده و اندازه اووسیت بستگی دارد . ظرفـیت تکامل بتدریج که قــطر اووسیت به 120-90 نانومتر می رسد افزایش می یابد (52-51) از فولیکولهایی که حداقل 5 میلی متر هستند. می توان اووسیت هایی گرفت که قابلیت بالغ شدن در محیط

in vitro را داشته باشند (البته بدون توجه به تحریک باگنادوتروپین) (53) میزان باروری در تخمک های با اندازه 10mm و بزرگتر افزایش می یابد.

جدول 3- 1- 7  بالای صفحه

 ایده تحریک کوتاه مدت با FSH قبل از IVM برای اولین بار توسط یکی از دستیاران که در آزمایشگاه Roger Golden ,s در سال 1995 کار می کرد مطرح شد ولی اثر تحریک کوتاه مدت با FSH ( بمقدار 150- 75 واحد در روز از روز 3 تا6) در رشد و باروری تخمکهای نابالغ گرفته شده از تخمدان فعلاً نا مشخص است . هر چند تعدادی از مطالعات (53 و50) گزارش نموده اند که حد اقل تعداد تخمکهایی که به مرحله متافازII می رسند دو برابر می شوند ولی دیگران اثرات مفیدی را در استفاده از این روش روی رشد و بلوغ اووسیت مشاهده نکرده اند (54)

از طرف دیگرمواجه اووسیت های نابالغ با دوز بالای (ovulating dose) HCG درست 36 ساعت قبل از گرفتن اووسیت اثرات مشهودی را در رشد و تکامل آنها در محیط in vitro داشته است و درصد اووسیتهای نا بالغی که وزیکول ژرمینال را شکسته و بمرحله متافازII  رسیده اند افزایش یافته است. بعلاوه مدت زمان لازم برای بلوغ آزمایشگاهی تخمک نیز کاهش یافته است ( 24 ساعت در مقابل 48 ساعت) و این مورد بر تطابق زمانی لازم جهت انجام IVF یا ICST  افزوده است . (55 و54) هرچند اووسیتهای (denuded) نیز می توانند تا متافازII   بالغ شوند ولی رشد اولیه امبریونیک در انها مورد سوال می باشد . بنظر می رسد وجود سلولهای کومولوس تولید یا اثـر هـورمونـهای خـاصـی را که برای IVM ضروری است موجب می شوند. (56)

حدود 7-5 درصد ازاووسیت هایی که در سیکل های IVF از بیماران بعد از تحریک تخمدان گرفته می شوند بصورت نابالغ و در مرحله

 (Germinal Vesicle) GV هستند .بخشی از این اووسیت ها ممکنست در محیط آزمایشگاه خود بخود بعد از برداشته شدن سلولهای کومولوس یا باروش کشتهای آزمایشگاهی بتوانند بالغ شوند . البته میزان تکامل این جور اووسیتها

 Left over) ( معمولاً پایین است (49) : در عین حال ما این تکنولوژی را در بیماران مبتلا به کانسری که تحت رژیم تحریک تخمدان برای گرفتن تخمک قرار گرفته اند مفید یافتیم تا از این اووستها برای فریز تخمک یا امبریو استفاده گردد.

در مرکز ما انجام IVM و سپس انجام ICSI در روز بعد. تعداد اووسیتهای بالغ و امبریو را به میزان 25-20% افزایش داده است ( تحقیقات منتشر نشده Oktay K) . تخمکهای نابالغ را می توان از تخمدانی که در طی عمل جراحی زنان از بدن خارج شده است و نیز از بافت تخمدان که برای انجماد جدا سازی شده  است نیز بدست آورد. (57 و 43)

در انتها استفادة آتی که از این تـکـنـیک خـواهـد شـد بـرای کلونینگ درمانی (therapeutic  cloning) (58) می باشد که هسته سلولهای سوماتیک برای تولید سلولهای جنینی مورد نظر انتقال داده می شود تا برای استفاده در بیماری که محتوی هسته را اهدا نموده است بکار برده شود. این روش در موش انجام شده (59) پاکسازی حافظه سوماتیک برای برنامه ریزی مجدد هسته (de-differentiation)  ضروری بود که البته این عمل معمولاً بعد از انتقال هسته بصورت کامل صورت نمیگیرد و لذا منجر به بروز انومالی های تکاملی متعدد و کاهش لانه گزینی امبریوکلون شده می گردد.

بلوغ آزمایشگاهی اووسیت پره انترال و پریموردیال

رشد و بلوغ فولیکول های پره انترال و پریموردیال یک مشکل تکنیکی بزرگ در علم باروری است . فولیکولهای پریموردیال ( 35 میکرومتر)  معمولاً اووسیت هایی هستند که با یک لایه مسطح از سلولهای پیش گرانولوزا پوشیده شده و رزرو تخمدانی را تشکیل می دهند.

فولیکولهای پره انترال ( 150-100 میکرومتر)  اووسیتهای اولیه در حال رشدی هستند که با لایه های متعدد (حداکثر 6 لایه) از سلولهای مکعبی گرانولوزا پوشیده شده اند و سلولهای تکا نیز از استرومای اطراف و غشاء پایه فولیکول ایجاد می گردد(60). فولیکولهای پریموردیال را می توان با استفاده از روشهای آنزیمی پارشیال و سپس تشریح مکانیکی جدا سازی نمود(61) و نیز می توان در محیط کشت ارگان رشد داد تا زمانیکه به مرحله ای از رشد برسند که بتوان به آسانی آنها را جدا  نمود . بعد از جدا سازی فولیکولها را می توان در ظرف پلاستیکی کشت حاوی ممبران کلاژن و لامینین و یا زیر روغن مینرال (62) کشت داد. آنها را همچنین می توان در محیط کشت ماتریکس سه بعدی خارج سلولی کشت داد.محیط کشتهای متعددی برای کشت فولیکولهای انترال و پریموردیال بکار گرفته شده است(60)

تا به امروز تولد زنده به دنبال کشت فولیکولهای پریموردیال در محیط آزمایشگاهی فقط در موش گزارش شده است(63) ولی در مورد فولیکولهای پریموردیال و پره انترال انسان مقدور نبوده است  . فاکتورهایی که رشد فولیکولهای پریموردیال و پره انترال را در محیط بدن و در محیط آزمایشگاه تحت کنترل دارند امروزه مورد تحقیقات وسیع قرار گرفته اند.

انجمادبافت تخمدان و پیوند آن :

تاریخچه

تولد نوزاد یک پستاندار که بدنبال پیوند ارتوتوپیک بافت تخمدانی فریز شده صورت گرفت برای اولین بار توسط  Parrot در سال 1960 در موش گزارش شد(63) Godsen در سال 1994 (64) تولد دو بره را به دنبال پیوند ارتوتوپیک بافت تخمدانی تازه و(  فریز- آب شده )  گزارش نمود Oktay در سال 2000(65) اولین مورد پیوند نوار کورتیکال تخمدان( فریز -آب شده ) را به صورت ارتوتوپیک در انسان گزارش نمود که موجب بازگشت فعالیت تخمدان بمدت محدود شده بود . اولین تولد نوزاد زنده انسان بدنبال پیوند ارتوتوپیک بافت تخمدان (فریز- آب شده) توسط Oktay در سال 2004 گزارش شد . در همان سال تولد یک میمون نیز بدنبال پیوند ارتوتوپیک تخمدان گزارش شد (66)Donnez  و همکاران در سال 2004 گزارشاتی را مبنی بر حاملگی و تولد نوزاد زنده به دنبال پیوند ارتوتوپیک قطعات کورتیکال تخمدان گزارش نمودند(67)

البته هرچند سوالاتی در مورد منشاء اووسیتهایی که منجر به حاملگی می شدند هنوز پابرجاست ولی این بیمار همچنان بصورت گاهگاهی از تخمدان باقیمانده خود تخمک گذاری می نماید.

حفظ باروری شامل تعدادی از روشها علاوه بر انجماد تخمدان نیز می باشد . الگوریتم مورد استفاده ما در زیر آورده شده است و اندیکاسیون اصلی انجماد بافت تخمدان بیماری های بد خیم می باشند.که نیازمند کموتراپی با داروهای گنادوتوکسیک  هستند.

خواص گنادوتوکسیک داروهای کموتراپی روی سلولهای تولید کننده استروئید و نیز روی اووسیت ها متغیر است (جدول 4-1-7) مواد الکیله کننده بیشترین اثر گنادوتوکسیک را دارند. اثرات مخرب سیکلوفسفاماید روی فولیکولها وابسته به دوز می باشد . مکانیسم عمل این دارو احتمالاً تداخل با چرخه سلولی و ایجاد آپوپتوزاست. زنان مسن تر نسبت به ایجاد نارسایی اولیه تخمدان مستعدتر هستند زیرا میزان ذخائر فولیکولهای پریموردیال در آنها کمتر است.

از طرفی حتی بعد از برقراری سیکل های قاعدگی در بیماران جوانتر احتمال ایجاد یائسگی زودرس در سالهای بعدی در آنها بیشتر است (68) استفاده از علائم

 ( قاعدگی- گرگرفتگی سن تقویمی) در بررسی رزرو تخمدان بعد از کموتراپی قابل اعتماد نیست . چندین روش منتشر شده برای تعیین رزرو تخمدانی در دسترس می باشد. که شامل ماکرهای بیوشیمیایی( سطح پایه و تحریک شده مقادیر FSH و LH استرادیول اینهیبین B - آنتی مولرین هورمون )- مارکرهای بیوفیزیکی( تعداد فولیکولهای انترال حجم تخمدان جریان خون استرومای تخمدان) یا تستهای دینامیک ( کلومیفن سیتراتtest    challenge تست تحریک GnRh - و تست تعیین رزرو تخمدان با FSH خارجی (69) می باشد.

مقادیر آنتی مولرین هورمون نقش اساسی را در تعیین رزرو تخمدانی دارد زیرا این هورمون از فولیکولهای پره ا نترال ترشح می شود و ساخته شدن پروتئین آن حتی در فولیکولهای پریموردیال نیز دیده می شود.

حفظ تخمدان به روش فارماکولوژیک:

سرکوب تخمدان با GnRh  بنظر نمی رسد اثری روی حفاظت از گنادها در زن یا مرد داشته باشد. ولی حفاظت از تخمدان با استفاده از درمان داروئی احتمالامقدور می باشد بعنوان مثال مطالعات اخیر نشان داده است که اپوپتوز اووسیت در جریان

 کمو تراپی و رادیاسیون را می توان با مهار ژن اسید اسفنگومیلیناز سرکوب نمود و این روش با استفاده از داروی اسفنگوزین -1- فسفات قابل انجام است. (71-70)

IVF با ترکیبات انتی استروژن

کانسر پستان شایعترین بدخیمی در زنان در سنین باروری می باشد هرچند شیوع آن در دهه های اخیر افزایش پیدا کرده است ولی مورتالیته حاصل از آن کاهش پیدا نموده است . 15 درصد از موارد کانسر پستان در زنان 40 سال یا جوانتر اتفاق می افتد . در حین درمان یک دورة 6 هفته بین جراحی و کموتراپی موجود می باشد که د ر این زمان انجماد اووسیت یا امبریو یا انجماد بافت تخمدان را می توان انجام داد .(72) از آنجائیکه روشهای معمول در تحریک تخمدان موجب افزایش سطح استروژن می شوند روشهای الترناتیو با استفاده از تاموکسیفن ولتروزل همراه با FSH در تحریک تخمدان در این بیماران استفاده می شود .(73- 72) وقتی تاموکسیفن بدین منظور استفاده شده تعداد اووسیت های بدسـت آمده تقریباً دو برابر شده و میزان کنسل شدن سیکل نیز کاهش یافته است (72)

یک مقایسه پروسپکتیواخیر بین تحریک تخمک گذاری با تاموکسیفن و لتروزول همراه با FSH با دوز کم نسبت به بیماران کانسر پستانی که این عمل  (IVF)  روی آنها انجام نشده بود صورت گرفت که میزان عود زود رس بیماری در دو گروه تفاوت چندانی نداشت.

در پروتکل لتروزول FSH نسبت به تاموکسیفن FSH سطح استرادیول پائینتر و تعداد اووسیتهای بدست آمده نیز بیشتر بود که موجب تولید تعداد امبریو بیشتری شد .(73)

لتروزول به تنهایی یا به همراه FSH ممکنست در انجماد اووسیت یا امبریو در بیماران مبتلا به کانسر اندومتر نیز مورد استفاده قرار گیرد.(74)

روشهای مورد استفاده در انسان و تکنیکها:

روشهای اصلی پیوند بافت تخمدانی با یا بدون انجماد در جدول( 5- 1- 7 )آورده شده است این عمل بیشترین کارایی را زمانی دارد که بافت تخمدان قبل از 40 سالگی منجمد شده باشد .(68)  تکنیک پیوند تخمدان بطور خلاصه در زیر آورده  می شود.

پیوند ارتوتوپیک قطعه کورتیکال تخمدان

Oktay  et al در سال 2001 (81) : قطعات کورتیکال تخمدان با استفاده از سوچررهای ویکریل (اتیکون) زیر یک میکروسکوپ میکروسرجیکال(strung)  می شوند و به یک قطعه مثلثی شکل از پلی سلولز قابل جذب متصل می گردند

 (surgical , Johnson & Johnson ) این قطعه از نوک آن با یک سوچور گرفته می شود و به طریق لاپاروسکوپی در یک حفره پریتونئال در جدار لگن کاشته می شود و سوزن از پریتونئوم رد می گردد تا بافت را در محل متصل نماید و سپس پریتونئوم روی آن بطریقه لاپاروسکوپیک بسته می شود.

Meirow et al در سال 2005  (83)  : پیوند قطعه کورتیکال منجمد آب شده در تخمدان منوپوز برای اولین بار توسط Oktay و همکاران گزارش شده بود. گروه Meirow گزارش نمودند که سه جفت انسیزیون 5 میلی متر  در کورتکس تخمدان در تونیکا البوژینه  ایجاد نموده و با تشریح کند برای هر کدام از نوارها در زیر کورتکس تخمدان حفره ای ایجاد نموده و هر قطعه از بافت تخمدان که از حالت انجمادخارج شده بود به ابعاد( 5/0 × 5/1 سانتیمتر)طول و عرض (  2/0 1/0 سانتیمتر)  ضخامت به آرامی در هر حفره قرارداده شد . وانسیزیون ها با ویکریل 0-4 سوچور شد.

پیوند هتروتوپیک قطعه کورتیکال تخمدان

Oktay et al در سال 2003 (76) : هر قطعه با یک نخ ویکریل 0-4 که از بین استرو ماو کورتکس زیر یک میکروسکوپ عبور داده می شود گرفته می شود و سپس سوزن آن بریده شده و یک انسیزیون 5/1 سانتی متری روی عضله براکیورادیالیس در حدود 10- 5 سانتی متر پایین تر از حفره آنته کوبیتال داده می شود . با استفاده از تشریح کند یک حفره بین فاشیا و بافت ساب کوتانئوس ایجاد می شود . توجه لازم برای اجتناب از  آسیب  وریدها و شریانهای بزرگتر بعمل می آید . بهتر است زیاد از کوتر استفاده نشود. پس از اینکه تشریح کامل شد انتهای نخ به یک سوزن نیمه حلقوی کاتینگ متصل می شود و سوزن را وارد این حفره نموده و تاجایی که ممکنست داخل میبریم . سپس از پوست خارج شده  و با کشیدن نخ متصل به این سوزن قطعه کورتیکال داخل این حفره زیر پوست قرار می گیرد. سپس سوزن خارج شده و انتهای آزاد نخ با یک موسکتیو گرفته می شود . علت استفاده از این نوع تکنیک هدایت قرار گرفتن بافت و جلوگیری از روی هم قرار گرفتن آنهاست و هدف تنها ثابت نمودن بافت نمی باشد . پس از جایگزاری تمام قطعات نخ ها بریده شده و انسزیون پوست به روش اینترادرمال یا ساب کوتیکولار سوچور می شود . یک پانسمان غیر فشاری نیز گذاشته می شود . برای پیوند قطعات در ناحیه زیر پوست سوپراپوبیک نیز از همین تکنیک استفاده می شود ( شکل 3-1-7)

پیوند یک تخمدان کامل  بهمراه پدیکول عروقی آن:

هرچند این روش در گوسفند موفقیت نسبی داشته است ولی انجماد یک تخمدان کامل در انسان هنوز ممکن نشده است . شاید این به علت بزرگتر بودن تخمدان در انسان و نیز عدم توانایی در انجماد توام اووسیتها و پدیکول عروقی آن می باشد . هرچند یک تحقیق فعال در این زمینه ( انجماد بافتی ) درحال انجام می باشد (84)

بی خطر بودن پیوند تخمدان :

 انتقال سلولهای بد خیم

احتمال متاستاز از اعضاء مختلف به تخمدان بستگی به نوع و مرحله کانسر دارد (جدول 6-1-7) (85) آزمایشات حیوانی در موش (لوکمی) و در تخمدان انسان (لنـفوم هوجکین) نتایج مختلفی داشته است . البته موردی از انتقال سلولهای بد خیم بعد از درمان و پیوند بافت منجمد شده تخمدان گزارش نشده است  ولی ایجاد روشهای دقیق بررسی وجود سلولهای بدخیم در گرافتهای تخمدان ضروری است . متدهای پیشنهادی علاوه بر استفاده میکروسکوپ نوری شامل آزمایش زنجیره پلی مرازوآزمایش Northern blot وایمونوهیستوکمیستری برای بررسی بروز میلوپراکسیداز در لوکمی میلوئید حاد می باشد . استراتژی های دیگر شامل پاکسازی سلولهای بد خیم از گرافت  با استفاده از آنتی بادی های خاص (86) و

  IVM    ( رشد و بلوغ آزمایشگاهی فولیکولهای پره انترال) (60) و گزنوگرافتینگ (87) (شکل 4-1-7 )می باشد .

سلولهای بنیادی امبریونیک و باروری در انسان:

سلولهای بنیادی امبریونیک (ESCs) ) سلولهای کلونوژنیک نامیرا با پتانسیل متعدد هستند که قدرت تمایز به هر سه لایه سلولی را دارا می باشند. سلولهای بنیادی بالغ (ASCs) سلولهای با پتانسیل منفرد یا محدود هستند که سلولهای بافتی را که از آن ایجاد شده اند تولید می نمایند.

البته بعضی از این سلولها ممکنست قدرت تمایز به سایر سلولها را در شرایط خاص حفظ کرده باشند. برای مثال سلولهای بنیادی بدست آمده از مغز استخوان می توانند قابلیت تمایز خطی (multipotent  Adult  progenitor cells) را نشان دهند

(Niche) یک محیط میکروسکوپی (microenvironment) می باشد که حاوی سلولها و سیگنالهای لازم برای کنترل رشد و نوسازی سلولهای بنیادی می باشد.

Totipotency سلولهای بنیادی امبریونیک

سلولهای توتی پوتنت سلولهایی هستند که قابلیت تمایز به سلولهای اکسترا امبریونیک و بافت امبریونیک را دارا می باشند و از سلول زیگوت اولیه بدست می آیند.  ولی سلولهای پلوری پوتنت فقط قابلیت تمایز به سلولهای امبریونیک را دارند و از توده سلول داخلی (ICM) یا بلاستوسیت بدست می آیند . توتی پوتنت بودن سلولهای ESCs  موش با قابلیت آنها در ایجاد  جرم سل پریموردیال که می تواند به گامت های نر یا ماده تبدیل شده و ساختمانی شبیه بلاستوسیت ایجاد نمایند و موجب تشکیل لایه های جنینی و تروفواکتودرم شوند نشان داده می شود(91-88)

علاوه بر این گامت های هاپلوئید نر که از ESCs بدست آمده توانایی بارور نمودن اووسیت موش و تشکیل بلاستوسیت را داشته است.

بدست آوری ESCs انسان

سلولهای بنیادی امبریونیک انسان را می توان از بافت های زیر بدست آورد

1-  لایه سلولی داخلی (ICM) در بلاستوسیت که بلاستوسیت در طی IVF و یا انتقال هسته بدست خواهد آمد.

2-  مورولا (94 و 93)

3- یک بلاستومر  از جنین 8 سلولی قبل از لانه گزینی (95)

روش اصلی که استفاده می شود بدست آوردن ESC از لایه سلولی داخلی بطریقه ایمونوسرجری می باشد . بلاستوسیت ها معمولاً توسط زنانی که IVF انجام می دهند اهدا می گردند. سپس Zona برداشته می شود و بلاستوسیت ها با antisera خرگوش مواجه شده و سپس به کمپلمان خوک(    guinea)  منتقل می شوند تا سلولهای تروفواکتودرم کشته شوند (96)

 این سلولها همراه با سلولهای تغذیه کننده امبریونیک که میوز آنها غیر فعال شده است کشت داده می شوند تا کلونی تشکیل گردد . محیط کشت حاوی فاکتور بازدارنده لوکمی وسایر فاکتورهای رشد و منبع پروتئین می باشد. کلونی ها هر هفته پاکسازی می شوند تا زمانی که یک رده سلولی واحد حاصل گردد(97)  سلولها در این زمان می توانند شکل یک قطره را به خود بگیرند ( جسم امبریوئید) این سلولها می توانند خود به خود بعد از کشت طولانی مدت به هر سه لایه زاینده و همچنین پریموردیال جرم سل (PGCs) تمایز یابند همانگونه که   Clarkو همکاران در سال 2004 بیان نمودند (98)

تشکیل پریموردیال جرم سل از ESCs

سلولهای بنیادی امبریونیک قابلیت تمایز به گامت نر EB (88) و گامت ماده در محیط کشت تک لایه( متصل) را دارند (90).

ESCs های نشان دارشده با سیستم خبر دهنده مخصوص

(Knock-in of Green flurcent protein GFP or B-D galactosidase) (Lacz)

ژنهای GFP یا Lacz در اکتامر -4- همئودومن فاکتور ترانس کریپشن خانواده POU یا وازاهومولوگ روش (muh) بدون سلولهای تغذیه کننده و یا فاکتور های رشد کشت داده شده اند.

BMP4 (مورفومتریک پروتئین 4 استخوان) یا رتینوئیک اسید بخاطر اثر میتوژنیک آن روی (PGCs) به محیط کشت افزوده می شود و کلونی ها یا EBs محیط کشت حاصل می گردد . سلولها در مدت 7 روز در این سیستم کشت رشد می کنند و تولید ژنهای خاص PGCs می نمایند.

شناسایی تشکیل پریموردیال جرم سل در محیط آزمایشگاهی

از آنالیز مارکرهای اختصاصی جرم سل برای شناسایی تمایز PGCs از ESCs استفاده می شود ( شکل 5-1-7) به علت همپوشانی زیاد این مارکرها در سلولهای سوماتیک ESC و PGC یک روش مختلط حاصل از آنالیز سکانسی مارکرها- مطالعات مورفولوژیک متدهای هستیوکمیکال و آنالیز بروز ژن استروئید سازی استفاده می شود (98 و90)

ایجاد اووسیت از ESCs

از روز 8 تا 12 در محیط کشت تجمع های سلولی حاصل از سلولهای سوماتیک و سلولهای (muh+) putative PGCs از بقیه سلولها جدا می شوند این سلولها جدا شده و در محیط کشت مخصوص IVM کشت داده می شوند. در طول یک شب این سلولها تمایز یافته و تبدیل به ساختمان های شبیه فولیکول می شوند . تا روز 16 در محیط کشت مارکرهای ورود به مرحله میوز (DMCI  , SCPs) را همراه با تغییرات مورفولوژیک و  تغییرات هسته ( تجمع کروماتین ) ظاهر می سازند .به عبارت دیگر سلولهای سوماتیک احاطه کننده شروع به ساخت مارکرهای سلولهای گرانولزا مانند (GDF و انزیمهای استروئید وژنیک و ترشح استروژن) می نمایند. تاروز

 25-23 در محیط کشت سلولهای شبیه اووسیت در این محیط شروع به تولید مارکرهای متافاز دو از قبیل ( پروتئین های زونا پلوسیدا . polar body  ودوک تقسیم) می نمایند در روز 45-42 ساختمانهای شبیه بلاستوسیت بصورت شناور در محیط کشت دیده می شوند این مارکرهای مربوط به امبریو قبل از لانه گزینی احتمالاً از فعال شدن پارتنوژنتیک اووسیت حاصل می گردند.(90)

آزمایشات مشابه ایجاد گامت ها پلوئید نر را از سلولهای ESCs در EB تا  20روز در محیط کشت را نشان داده است. بعد از انتقال آنها به بیضه فرد گیرنده آنها قادر به اسپرماتوژنز بوده و اسپرماتوزوئید های حاصله قادر به بارور نمودن اووسیت در فرایند ICSI بوده اند(89 و88)

هرچند این تکنولوژی در اوان کودکی خود بسر می برد ولی تمایز خود بخود سلولهای جرم سل از سلولهای ESCs در محیط کشت آزمایشگاهی تأثیرات عمیقی را روی بیولوژی باروری و طب باروری خواهد گذاشت.  

نتیجه:

قول بزرگی می دهیم که این قرن پیشرفتهای مهیجی را در زمینه کاری ما بهمراه داشته باشد . بکارگیری تکنیکهای مولکولی و کرایوپرزرویشن و سلولهای بنیادی احتمالاً نگاه ما را به محدودیت های موجود در سنین باروری تغییر خواهد داد. از آنجائیکه تعداد افراد سالمند روز به روز بیشتر می شود . طب سالمندان تبدیل به یک رشته فوق تخصصی عمده شده  است و حفظ باروری یکی از جنبه های مهم در رشته ما خواهد بود زیرا تمایل به عقب انداختن زمان باروری روز به روز افزایش می یابد.

تمایل به عقب انداختن باروری نه تنها به علت عوامل اجتماعی می باشد بلکه به علت افزایش طول عمر و افزایش میزان بقا در برابر بیماریهای بد خیم و بیماریهای ناتوان کننده دیگر است.

یک دیدگاه با ذهنیت باز می تواند پیشرفت ها را تسهیل نموده و مارا قادر سازد تا به بیماران خود کمک کنیم تا کیفیت زندگی خود را بهتر نمایند.